Samstag, 03.10.2020

14:00 - 15:30

Poster DGfN 2020

Experimentelle Nephrologie 4 (P177 - P185; LA37 - LA38)

 
Immune checkpoint protein BTLA attenuates inflammation and glomerular damage in experimental glomerulonephritis
P177 

M. Brand, P. Diefenhardt, T. Schömig, B. Trinsch, B. Schermer, P. T. Brinkkötter, T. Benzing, S. Brähler; Köln

Objective: Although Glomerulonephritis (GN) is one of the leading causes of end stage renal disease, the exact pathomechanisms remain poorly understood. The common denominator of this heterogeneous group is a misbalance in pro- and anti-inflammatory signals, leading to glomerular loss of function and histological scarring. However, current treatment with non-specific immunosuppressants has detrimental adverse effects and often inadequate outcome, making the development of more effective treatment strategies necessary. The immune checkpoint molecule B and T lymphocyte attenuator (BTLA) was shown to have anti-inflammatory effects in several mouse models of autoimmune diseases by regulating T cell activation. Here we attempt to define the function of BTLA in a mouse model of immune-complex mediated GN (NTN).
Results: Using RNAsequencing of sorted mouse dendritic cells, we found BTLA to be strongly upregulated in the cDC1 subset, which was recently identified to have robust anti-inflammatory properties in NTN. To further evaluate the role of BTLA, we challenged BTLA-KO mice with the NTN model. No basal phenotype or spontaneous autoimmunity was observed in untreated, healthy mice. During NTN, KO mice exhibited aggravated glomerular damage  as well as significantly elevated albuminuria and blood urea nitrogen levels compared to WT mice. Flow cytometry analysis at day 14 showed higher frequencies of infiltrating immune cells in the kidneys of KO mice. Furthermore, Th17 cell and regulatory T cell immunity were significantly elevated compared to WT controls.
Conclusion: In conclusion, our data supports an immunosuppressive role of BTLA during GN by modulating T cell function. While the precise molecular mechanisms and especially the involvement of cDC1s will have to be investigated further, BTLA represents a promising therapeutic target for the specific treatment of GN.

 
High hydrostatic pressure for tissue divitalization and development of kidney 3D tissue models
P178 

H. Salti, S. Mitzner, R. Wasserkort; Rostock

Objective: The global prevalence of chronic kidney disease (CKD) is progressing at an alarming rate affecting more than 10% of the world population. Current treatment options include dialysis and kidney transplantation, which are considered unsatisfactory for both medical and patient well-being reasons. The application of tissue engineering principles in the future for the development of bioartificial kidneys would be a considerable gain. This project aims at developing 3D kidney models for the investigation of recellularization strategies with the long-term purpose of producing bioartificial kidneys. Proven methods of decellularization include chemical treatment by perfusion with chemicals, as well as repeated freezing-thawing cycles as a physical treatment. On the other hand, cells devitalization using high hydrostatic pressure (HHP) followed by a short perfusion with chemicals, represents a potentially more scaffold friendly approach.
Method: Rat kidneys were decellularized using two different approaches: chemical treatment via arterial perfusion and physical treatment with HHP combined with subsequent perfusion with chemicals. The kidneys were decellularized using three previously published protocols: 1) perfusion with 1% SDS, 2) perfusion with 1% Triton X-100 and 0.1% SDS. To examine the effects of physical treatment, the kidneys will be treated with HHP and then further decellularized with different perfusion durations of the protocols 1 and 2. Furthermore, the efficiency of freezing-thawing cycles as a proven physical decellularization method was compared to HHP treatment. The kidneys were first treated physically and then further perfused with 0.1% Triton X-100 and 0.5% SDS.
Results: Precision-cut kidney sections were decellularized through two different approaches: 1) chemical treatment 2) physical treatment (HHP) in combination with a shorter chemical treatment procedure. While the second approach resulted in almost completely decellularized kidney sections after only 3.5 hours of treatment, the chemically treated kidney sections did not show complete decellularization even after 30 hours. The HHP treated kidney sections showed a clearly visible discoloration (transparent) compared to the chemically treated kidney sections (white/reddish) (Figure 1).

P178


Conclusion: Preliminary results showed that HHP treatment can significantly shorten the detergents perfusion time and thus possibly reduce damage to the scaffold. A more precise assessment of the decellularization quality will be carried out in the upcoming phase of the project.

 
CRISPR/Cas9 Knockout der Gene MERTK, NPR3 und ITM2B in einer humanen und einer Maus-Podozyten-Zelllinie
P179 

S. Wittösch, H. Aypek, T. B. Huber, F. Grahammer; Hamburg

Hintergrund: Die Filtration des Blutes zur Bildung des Primärharns findet in den Glomeruli der Nieren über die Filtrationsbarriere statt, die urinseitig von Podozyten gebildet wird und deren weit verzweigte Fußfortsätzchen die Schlitzmembran aufbauen. Die Proteine Nephrin, Neph1 sowie Podocin bilden die Hauptbestandteile der strukturell einzigartigen Schlitzmembran. Weitere Untersuchungen des Interaktoms dieser Schlüsselproteine identifizierten eine Reihe von Kandidaten, von denen MERTK, ITM2B und NPR3 aus funktionellen Gründen für eine weitergehende Analyse besonders interessant erscheinen.
Methode: Zur weiteren Charakterisierung ihrer Funktion wurden in einer podozytären Maus- und humanen Zelllinie die jeweiligen Gene ausgeschaltet. Dabei wurden die jeweiligen Zelllinien einem Genome Editing Prozess unterzogen, der über das CRISPR/Cas9 System vermittelt wurde. Nach erfolgter Transfektion wurden die Zellen mittels FACS vereinzelt und so das Heranwachsen von Einzelzellkolonien ermöglicht. Durch ein anschließendes Screening wurden sowohl Knockout- als auch Wildtyp-Zellen identifiziert, die für weitere funktionsanalysierende Experimente verwendet werden können.
Ergebnisse: Im Screening konnten sowohl für NPR3 als auch MERTK und ITM2B jeweils drei Knockout-Klone und drei Wildtyp-Klone identifiziert werden, deren Geno- als auch Phänotyp in einem enzymatischen Restriktionsverdau, mittels Sequenzanalyse und anschließend im Western Blot gezeigt werden konnte.
Zusammenfassung: Das Wissen über den genauen strukturellen Aufbau der Schlitzmembran ist das Fundament für ein tiefgreifendes Verständnis der physiologischen Vorgänge und der Pathomechanismen renaler Erkrankungen. Die Generierung von Knockout-Zelllinien ist der erste Baustein in einer sequenziellen Analyse, um die funktionelle Bedeutung von MERTK, ITM2B und NPR3 als Schlitzmembran-Interaktoren in-vitro zu untersuchen.

 
Verkürzte Erythrozyten-Lebensdauer und Eisenmangel als Ursache der Anämie beim experimentellen nephrotischen Syndrom
P180 

R. Bissinger, B. Bohnert, D. Essigke, M. Wörn, M. Xiao, Z. Kalo, K. Omage, F. Lang, S. Qadri, F. Artunc; Tübingen, Hamilton/CDN

Hintergrund: Die renale Anämie ist häufig mit einem Eisenmangel vergesellschaftet. Ein weiterer Grund könnte auch ein vermehrter suizidaler Erythrozytentod (Eryptose) sein, der zu einer verminderten Lebensdauer der Erythrozyten mit nachfolgender Clearance aus der Blutbahn führt. Sowohl die Niereninsuffizienz als auch Eisenmangel stimulieren die Eryptose. Bei der Doxorubicin-induzierten Nephropathie der Maus kommt es zur Ausbildung einer Anämie, die eine Untersuchung dieser Mechanismen in vivo erlaubt.
Methode: Die Untersuchungen wurden in Wildtyp-129S1/SvImJ-Mäusen durchgeführt. Zur Induktion der Nierenschädigung erfolgte eine einzelne i.v.-Injektion von Doxorubicin (14,5 µg/g KG). Blut- und Urinproben von Doxorubicin- und Vehikel-injizierten Mäusen wurden über 30 Tage gewonnen. Die PS (Phosphatidylserin)-Exposition der Erythrozytenmembran wurde durch Annexin V-FITC durchflusszytometrisch bestimmt. Der Eisen-, Ferritin und Transferringehalt im Serum wurde mittels ELISA und Western Blot untersucht. Die Erythrozyten-Lebensdauer in vivo wurde mittels des Farbstoffes 5(6)-CFDA,SE durchflusszytometrisch analysiert.
Ergebnisse: Nach der Induktion mit Doxorubicin entwickelten die Mäuse (n=10-19) eine massive Proteinurie (199 ± 36 mg/mg Kreatinin) und eine fortschreitende  Nierenschädigung (Harnstoff: 369 ± 44 mg/dl an Tag 30), die bereits ab Tag 10 mit einem signifikanten Abfall des Hämoglobins von 15,4 ± 0,2 g/dl auf 11,2 ± 0,3 g/dl einherging. Gleichzeitig konnte eine gesteigerte PS-Exposition (4,2 ± 0,9 % vs. 1,0 ± 0,1% bei Kontrollmäusen) sowie eine verkürzte Lebensdauer der Erythrozyten (Anteil markierter Erythrozyten in der Zirkulation 17,3 ± 3,0 % vs. 29,6 ± 2,3 % bei den Kontrolltieren) ausgemacht werden. Parallel dazu konnte ein signifikanter Abfall der Eisenkonzentration im Serum (55 ± 5 vs. 175 ± 13 µg/dl bei den Kontrolltieren) nachgewiesen werden, da hohe Mengen an Eisen über den Urin verloren gingen (Urin-Eisenkonzentration 269 ± 29 µg/dl). Im Western Blot war eine hohe Ausscheidung von Transferrin über den Urin nachweisbar.
Zusammenfassung: Die Doxorubicin-induzierte Nephropathie führt zur Ausbildung eines Eisenmangels aufgrund massiver Eisenverluste über den Urin. Gleichzeitig ist die Eryptose stimuliert, was zu einer verkürzten Lebensdauer der Erythrozyten führt. Der Eisenmangel könnte hierbei eine bedeutende Rolle spielen.

 
The influence of Vitamin D on podocyte differentiation in situ and in vitro.
P181 

T. Lange, L. S. Kuhn, M.-C. Böttcher, S. Simm, E. Hammer, L. Kaderali, C. Weber, K. Endlich, N. Endlich; Greifswald

Objective: Chronic kidney disease (CKD) is a major public health burden with a continuously rising incidence. Dedifferentiation of podocytes and the related changes of their complex morphology and the underlying molecular biological processes are main drivers in the development of CKD. Since there is no causal therapy for CKD, inadequate treatment subsequently leads to end-stage-renal disease making dialysis and renal replacement therapy inevitable. This highlights the need for new drugs, to expand the current treatment options for CKD patients. Vitamin D is a promising candidate that is controversially discussed currently. In this study we investigated the influence of vitamin D on podocyte differentiation in situ and in vitro.
Method: We applied a podocyte dedifferentiation model (GlomAssay) combined with an automated imaging procedure (Aquifer Imaging Machine). We used vitamin D- and analogue- (calcipotriol) treated cultured glomeruli from transgenic mice expressing cyan fluorescent protein (CFP) under the control of the nephrin promoter, as a measure for podocyte differentiation. Furthermore, vitamin D-, calcipotriol- and vitamin D receptor (VDR) inhibitor- (PS121912) treated glomeruli were investigated by RNA-Seq and LC-MS/MS to elucidate the molecular biological effect of vitamin D on podocyte differentiation. In addition to this, we treated cultured murine podocytes with vitamin D, calcipotriol and PS121912 and analyzed the morphological and molecular changes by immunofluorescence staining, RT-qPCR and Western Blot.
Results: Our results revealed that vitamin D and calcipotriol treated glomeruli show a significantly enhanced CFP fluorescence intensity compared to control treated glomeruli after 9 days of cultivation. This was accompanied by increased transcript and protein levels of nephrin, CFP, and VDR in comparison to controls. We could also observe unique molecular patterns within the transcriptomes and proteomes of the single treatment groups and observed differential expression of genes involved in vitamin D- and Wnt-signaling, actin cytoskeleton, slit diaphragm and focal adhesion. Cultured podocytes showed an altered morphology after vitamin D treatment with a rearrangement of the actin cytoskeleton and the development of cellular protrusions. They also show a significant upregulation of nephrin, VDR and CYP24A1.
Conclusion: Our results suggest that vitamin D and its analogue calcipotriol have an antagonistic effect on podocyte dedifferentiation in situ and in vitro.

 
Prostaglandin E2-Stimulation induziert den Transkriptionsfaktor NR4A1 in humanen Podozyten über EP2- und EP4-Rezeptoren.
P182 

E. Mangelsen, K. Böhme, C. Plum, P. Karsten, A. Schulz, A. Kourpa, D. Panáková, R. Kreutz, J. Bolbrinker; Berlin

Hintergrund: Bei der glomerulären Hyperfiltration führt erhöhter Scherstress durch den Flüssigkeitsstrom (fluid flow shear stress, FFSS) des Ultrafiltrats zu einer Podozytenschädigung und damit einer Störung der Filtrationsbarriere. Prostaglandin E2 (PGE2) scheint bei diesen Prozessen als Mediator eine zentrale Rolle zu spielen. Des Weiteren wurde durch FFSS eine Hochregulation des Transkriptionsfaktors Nr4a1 (nuclear receptor subfamily 4 group A member 1) in murinen Podozyten detektiert. Nr4a1 vermittelt in vitro proapoptotische Wirkungen und zeigte in vivo nephroprotektive Effekte. Ziel war es daher, die direkte Wirkung einer PGE2-Stimulation sowie von FFSS auf NR4A1 in einer humanen Podozyten-Zelllinie (hPC) sowie mögliche Signalwege zu untersuchen.

Methode: Die Genexpressionsanalyse in differenzierten hPC nach Stimulation mit PGE2 (10nM, 100nM, 1µM) über 2h in serumfreiem Medium erfolgte mittels Real-Time PCR. PF-04418948 (1µM) wurde als selektiver Antagonist für den PGE Rezeptor (EP) 2 (EP2) und ONO-AE3-208 (1µM) als EP4-Antagonist eingesetzt. FFSS erfolgte mit dem Flexcell Streamer (Dunn Labortechnik) in serumfreiem Medium mit 2dynes/cm² über 2h.

Ergebnisse: Unter basalen Bedingungen exprimieren differenzierte hPC mRNA für EP1, EP2 und EP4; NR4A1 wird an der unteren Nachweisgrenze detektiert. Eine PGE2-Stimulation über 2h induziert die NR4A1 Genexpression konzentrationsabhängig etwa um den Faktor 9 (10nM PGE2, p<0,01 vs Kontrolle; 2 Einzelexperimente [N=2], je n=5-6), Faktor 32 (100nM PGE2, p<0,01 vs Kontrolle; N=6, je n=3-6) bzw. Faktor 64 (1µM PGE2, p<0,01 vs Kontrolle; N=5, je n=3-8). Die über 100nM PGE2 induzierte NR4A1-Expression wird durch eine zeitgleiche Inhibition von entweder EP2 oder EP4 nur unvollständig vermindert (je N=3, je n=3-6). Die gleichzeitige Ko-Inkubation mit EP2-Antagonist plus EP4-Antagonist verhindert den PGE2-induzierten Expressionsanstieg von NR4A1 dagegen vollständig (N=3; je n=5-6). Erste FFSS-Experimente zeigen eine Induktion von NR4A1 in hPC (Faktor 4, p<0,01 vs Kontrolle; N=2, je n=5-6).

Zusammenfassung: Eine direkte PGE2-Stimulation vermittelt ebenso wie FFSS eine Induktion von NR4A1 in hPC. Der PGE2-Effekt wird dabei nur durch die kombinierte Inhibition von EP2 und EP4 aufgehoben. Ob diese Rezeptoren eine Rolle bei der FFSS-vermittelten Nr4A1-Hochregulation spielen, muss zukünftig untersucht werden. Eine Aufklärung der Rolle von NR4A1 in diesem Kontext könnte dazu beitragen, mögliche nephroprotektive Targets zu identifizieren.

 
Polycystin-1-Defizienz führt zu einer Induktion HIF-1a- und ATP-abhängiger Sekretion in Sammelrohrzellen
P183 

J. Scholz, A. Kraus, K. Skoczynski, M. Schiffer, B. Buchholz; Erlangen

Hintergrund: ADPKD führt zu kontinuierlich wachsenden Nierenzysten. Hierfür ist meist eine Mutation im PKD1-Gen in Hauptzellen des Sammelrohrs und somit Defizienz von Polycystin-1 (PC1) ursächlich. Hauptzellen bilden in vitro durch cAMP und Ca2+ abhängige Cl--Sekretion Zysten. Die Cl--Sekretion wird dabei durch purinerge Signaltransduktion vermittelt. Unter Hypoxie wird diese durch den Hypoxieinduzierbaren Faktor HIF-1a zusätzlich induziert. Diese für canine Hauptzellen (principal-like MDCK (plMDCK) cells) beschriebenen Effekte sollten nun in PC1-defizienten Subklonen untersucht werden.
Methode: Durch CRISPR/Cas wurden PC1-defiziente Subklone erstellt. Ihr Zystenwachstum in einer 3D-Matrix wurde durch Stimulation mit ATP sowie P2Y-Rezeptor-Inhibition durch Suramin untersucht. Mittels Western Blots wurde die Expression des purinergen Rezeptors P2Y2R, des ATP-Transporters Pannexin-1 und des Ca2+-aktivierten Cl--Kanals TMEM16A (Anoctamin 1) untersucht. Wegen bekannter hypoxischer Regulation dieser Gene untersuchten wir die Expression von HIF-1a.
Mittels automatisierter Auswertung wurden die 3D-Phänotypen von PC1-defizienten und Kontrollzellen untersucht. Den Einfluss von cAMP untersuchten wir durch Forskolin-Applikation sowie Messung der cAMP Konzentrationen.
Ergebnisse: PC1-defiziente Zellen bilden unter Kontrollbedingungen spontan Zysten. Dies korreliert mit einer signifikant erhöhten cAMP-Konzentration. Steigerung von cAMP führt auch bei Wildtyp-Zellen zur Zystenbildung, die sonst zu einem großen Anteil tubuläre Strukturen bilden. Des Weiteren weisen PC1-defiziente Zysten ein stärkeres ATP-abhängiges Wachstum auf. Passend hierzu zeigten sich P2Y2R, Pannexin-1 und TMEM16A in PC1-defizienten Zellen vermehrt exprimiert. TMEM16A-Inhibition durch Niclosamid hemmt das Wachstum PC1-defizienter Zysten signifikant. Darüber hinaus findet sich eine gesteigerte Expression von HIF-1a als mutmaßliche Ursache für die Induktion von P2Y2R, Pannexin-1 und TMEM16A.
Zusammenfassung: PC-1 Defizienz führt in vitro zu einer häufigeren Zystenbildung und einem stärkeren ATP-abhängigen Wachstum, das durch Pannexin-1, P2Y2R und TMEM16A vermittelt wird. Ursächlich ist hierfür mutmaßlich die vermehrte Expression des Transkriptionsfaktors HIF-1a. Weitere hypoxieunabhängige Ursachen wie Unterschiede im Metabolismus PC1-defizienter Zellen untersuchen wir derzeit noch.

 
Transcriptional auto-regulation of Hypoxia-inducible factors in renal cells
P184 

S. Naas, S. Grampp, V. Lauer, J. Schödel; Erlangen

Objective: Dysregulation of the Hypoxia-inducible factor (HIF) pathway has been reported to be critical to the tumorigenesis of kidney cancer. The activity of HIFs is predominantly controlled at the protein level via oxygen-dependent degradation of the α-subunit of these transcription factors. Apart from these well-studied processes, insights into the transcriptional regulation of HIF genes remain limited. The underlying mechanisms mediating an increased expression of HIF-2α in renal cancer may relate to epigenetic and (post)-transcriptional processes. In this study, we aim at unveiling aspects of transcriptional regulation of HIF-2α in primary human renal tubular cells (PTC) and renal cell carcinoma (RCC).
Method: PTC and tumour cells were isolated from tumour nephrectomy specimens. Analyses of chromatin structure and HIF DNA-interactions were done by FAIRE-seq and ChIP-seq experiments, respectively. Reporter assays and characterization of 786-O cells displaying a CRISPR/Cas9-mediated knockout of identified regulatory elements allowed validation of enhancer function. Target gene expression was measured by western blotting and RNA analysis.
Results: HIF-2α mRNA expression increased significantly in PTC upon HIF stabilization in a large collection of primary human cells. Inspection of HIF-binding data generated by ChIP-seq in these cells revealed HIF-DNA interactions approximately 200kb upstream of the HIF-2α gene within an intronic region of PRKCE, which is not regulated by HIF. Moreover, ChIP-seq data from 786-O RCC cells demonstrated an additional HIF-binding signal at an enhancer interposed between the two genes. Open chromatin and HIF interactions at this second regulatory site were detectable predominantly in RCC cells suggesting a complex and rather cancer-specific function of this enhancer. However, reporter gene assays confirmed the potential regulatory role of both HIF-binding sites in hypoxia. To assess functional consequences of the presumed enhancers on HIF-2α regulation, we mutated hypoxia-responsive elements within these sites using CRISPR/Cas9 in 786-O cells. Mutations in either enhancer led to reduced mRNA expression of HIF-2α. These results suggest that the enhancers may operate via long-range interactions to upregulate HIF-2α expression.
Conclusion: In conclusion, our data indicate that the upregulation of HIF-2α expression in renal cancer may be mediated to a certain extent by an auto-regulatory loop in which HIF-binding to promoter-distal regulatory elements trans-activates HIF-2α expression.

 
Nephronophthisis-associated MAPKBP1 interacts with JNK and AURORA Kinases
P185 

C. Hartig, R. Schönauer, L. Pöschla, M. Nemitz-Kliemchen, J. Halbritter; Leipzig

Objective: Nephronophthisis (NPH) is an autosomal-recessive kidney disease and accounts for the majority of cases of end-stage renal disease (ESRD) in the first three decades of life. Mutations in MAPKBP1, encoding the still poorly characterized c-Jun N-terminal kinase-binding protein 1 (JNKBP1), have been associated with NPH. MAPKBP1 was recently characterized as microtubule-binding protein that localizes to centrioles and the ciliary base depending on its C-terminal dimerization domain. In this study, we aim at investigating possible interactions with JNK proteins and AURORA kinases to unravel their influence on the intracellular localization of MAPKBP1 and its potential role in cell cycle regulation.
Method: Non-ciliated HEK and Hela as well as ciliated IMCD cells were used as model systems to study intracelluar interactions of transiently transfected wildtype and mutant MAPKBP1 constructs with cell-cycle related kinases by co-immunoprecipitation and immunofluorescence microscopy experiments.
Results: GFP-labeled wildtype MAPKBP1 was found to co-localize with AURORA A and B kinases as well as JNK1/2 in transiently transfected Hela and IMCD cells. In a next step we aimed at investigating implications for MAPKBP1-JNK-interactions and constructed the mutant MAPKBP1_delD variant lacking an 8 residue stretch (consensus D-domain derived from the MAPKBP1 paralog WDR62) located within the putative JNK-binding region (JBD). Interestingly, MAPKBP1_delD was able to localize to the microtubular network, centrosomes and cytosolic granules comparable to the wildtype protein. However, in contrast to wildtype, co-expression of MAPKBP1_delD completely abrogated intracellular co-localization with JNK1/2. Furthermore, a construct lacking the complete JBD, was localized only to the cytosol, suggestive of additional regulatory sequences within this domain required for correct MAPKBP1 microtubule association.
Conclusion: Here, we identified and characterized the JNK binding site (D-domain) of NPH-associated MAPKBP1. Furthermore, we discovered AURORA kinases as novel interaction partners of MAPKBP1. Differential interaction of MAPKBP1 with these kinases might regulate the distinct localization of MAPKBP1 during the cell cycle, similar to its paralog WDR62. Deeper insights into the physiological role of MAPKBP1 may help to provide new targets for treatment strategies in NPH.

 
Fibrosis and immune cell infiltration are separate events regulated by cell-specific receptor Notch3 expression
LA37 

S. Brandt, T. M. Ballhause, A. Bernhardt, A. Becker, D. Salaru, H. Le-Deffge, A. Fehr, Y. Fu, L. Philipsen, S. Djudjaj, A. Müller, R. Kramann, M. Ibrahim, R. Geffers, C. Siebel, F. Heidel, J. Lindquist, P. R. Mertens; Magdeburg, Hamburg, Aachen, Braunschweig, South San Francisco/USA, Jena

Objective: Kidney injuries that result in chronic inflammation initiate crosstalk between stressed resident cells and infiltrating immune cells. In animal models, whole body receptor Notch3-deficiency protects from leukocyte infiltration and organ fibrosis, however the relative contribution of Notch3 expression in tissue versus infiltrating immune cells is unknown.
Method: We generated chimeric mice lacking Notch3 in hematopoietic cells and/or resident tissue cells. Kidney fibrosis and inflammation were analyzed following unilateral ureteral obstruction (UUO). We validated our results using adoptive transfer of labeled bone marrow-derived cells in a murine Leishmania ear infection model. In vitro adhesion assays, integrin activation and extracellular matrix production were analyzed. 
Results: Diseased kidneys showed a prominent NOTCH3 expression in pericytes, vascular smooth muscle cells, and mesangial cells. Following UUO fibrosis ensues, however, inflammatory cell infiltration mostly depends on Notch3 expression by hematopoietic cells. This coincides with an enhanced pro-inflammatory milieu (e.g. CCL2, CCL5 upregulation). We confirm a prominent role of Notch3 expression on CD45+ leukocytes for efficient cell transmigration. Functionally, leukocyte adhesion and integrin activation are abrogated in the absence of receptor Notch3. Chimeric animal models also reveal that tubulointerstitial fibrosis develops even in the absence of prominent leukocyte infiltrates following ureteral obstruction. Kidney fibrosis is blunted when Notch3 receptors are deleted on resident cells, NF-κB signaling is ablated, and less matrix deposition is detected. In vitro analysis using primary tubular cells revealed a Notch3 dependent production of the extracellular matrix protein tenascin-C and NF-κB activation.
Conclusion: Taken together, leukocyte infiltration and organ fibrosis are distinct, separable molecular events that to a large extent are independently orchestrated via cell-specific receptor Notch3 signaling. Interference with Notch3 signaling fulfills promises as a therapeutic approach in inflammatory as well as fibrotic diseases.

 
Der Einfluss des Kälteschockproteins DbpA (DNA-Bindungsprotein A) auf die Barrierefunktionen in der Niere
LA38 

C. Reichardt, S. Sleiman, S. Brandt, A. Bernhardt, J. Lindquist, B. Isermann, A. Dudeck, P. R. Mertens; Magdeburg, Leipzig

Hintergrund: DbpA gehört zur Familie der menschlichen Kälteschockproteine mit Einfluss auf die Zellproliferation, die Transkriptions-/Translationsregulation und die Zell-Zell-Kommunikation. In diesem Projekt wird untersucht, ob eine genetischer Verlust des Kälteschockproteins DbpA einen Einfluss auf die epitheliale Zelldifferenzierung, die Barrierefunktion und die mitochondriale Respiration bei akuter Nierenschädigung (Ischämie/Reperfusion) hat.
Methode: Basierend auf der Ischämie/Reperfusion in vivo wird das Hypoxie- und Reoxygenierungs-Modell für primäre tubuläre Nierenepithelzellen aus Mäusen für die in vitro Analysen durchgeführt. Die Metabolismusanalyse erfolgt mithilfe des Seahorse extracellular flux 96 Analyzer (Agilent Technologies). Zur Analyse der tubulären Epithelzellen wurden Immunhistochemie-Färbungen von Nierengewebeschnitten von Mäusen durchgeführt.
Ergebnisse: In vitro Analysen zeigen eine zytoplasmatische Expression von DbpA in nicht konfluenten Zellen und eine Membranlokalisation (Tight junctions) in konfluenten Zellen. Zudem konnte in vitro eine Co-Lokalisation von DbpA mit Mitochondrien gezeigt werden. DbpA ist bei der mitochondrialen Respiration in tubulären Epithelzellen beteiligt. Primäre DbpA knockout Tubuluszellen zeigen beispielsweise eine reduzierte basale Respiration, maximale Respiration, Atmungskapazität und nicht mitochondrialen Sauerstoffverbrauch im Vergleich zu primären DbpA wildtyp Tubuluszellen. Bei einem genetischen Verlust von DbpA ist die Expression des Zell-Zell-Kontaktproteins E-Cadherin in tubulären Strukturen in den Nieren von Mäusen signifikant erhöht. Diese Daten weisen auf eine Relevanz des Kälteschockproteins DbpA bei maladaptiven Prozessen an der physiologischen Filtrationsbarriere der tubulären Strukturen hin.
Zusammenfassung: DbpA agiert möglicherweise als zellulärer Stress-Sensor während der Ischämie/Reperfusion. Wie das Protein schützende oder schädliche Wirkungen vermittelt, steht im Mittelpunkt des Projekts.

Zurück






Fragen und Antworten der Posterbewerter und Autoren

Nur Posterbewerter und Autoren dieser Postergruppe können Fragen/Antworten erstellen.
Sie müssen sich anmelden, um Kommentare hinzuzufügen.