Samstag, 03.10.2020

14:00 - 15:30

Poster DGfN 2020

Akutes Nierenversagen 2 (P119 - P127; LA27 - LA29)

 
Die Rolle der RNA-bindenden Musashi-Proteine in der akuten Nierenschädigung
P119 

L. Seufert, M. Ignarski, R. Esmaillie, K. Bohl, B. Schermer, T. Benzing, R.-U. Müller; Köln

Hintergrund: Unsere Gruppe konnte anhand der Durchführung vergleichender Screens mittels RNA-Sequenzierung und Proteomics in Mausmodellen der akuten Nierenschädigung und Präkonditionierung eine Gruppe von Proteinen/Transkripten identifizieren, welche nach Schädigung und/oder Präkonditionierung (Kalorienrestriktion oder Hypoxie) in der Niere differenziell reguliert sind. Diese werden nun mit dem Fokus auf eine spezielle Gruppe von RNA-bindenden Proteine (RBP) – den Musashi Proteinen - mechanistisch untersucht. RBPs spielen durch Interaktion mit kodierenden und nicht-kodierenden RNA-Molekülen eine bislang unterschätzte Rolle bei der Regulation nahezu jeden Schritts der RNA-Biologie, so dass auch eine Funktion bei akuter Nierenschädigung naheliegend ist.
Methode: Zunächst wird die RNA-bindende Funktion der Proteine im Rahmen eines sogenannten PNK (Polynukleotidkinase) Assays durch Immunpräzipitation und radioaktive Markierung der RNA validiert. Die exakten Ziel-RNAs der RBPs werden anschließend mit eCLIP (enhanced crosslinking and immunoprecipitation) ermittelt werden. Weiterhin wird die Lokalisation der Musashi-Proteine in Nieren mit akuter Nierenschädigung mittels Immunfluoreszenz untersucht. Durch einen konditionellen Knockout der Musashi-kodierenden Gene in der Niere wird deren Funktion im Kontext des akuten Nierenversagens und dessen Prävention im Mausmodell untersucht.
Ergebnisse: Eines der am stärksten differentiell regulierten RBPs in unseren Screens ist Musashi-1 (Msi-1). Die RNA-bindende Funktion von Msi-1 konnte im PNK Assay festgestellt werden. In der ungeschädigten Niere ist Musashi-1 an der apikalen Membran distaler Tubuluszellen detektierbar. Im Gegensatz dazu ist Musashi-1 in Nieren mit akuter Nierenschädigung vermehrt im Cytoplasma des proximalen Tubulus exprimiert. Dieses spezifische Expressionsmuster deutet auf eine Rolle von Musashi-1 in der akuten Nierenschädigung hin.
Zusammenfassung: Durch die Regulation in der akuten Nierenschädigung und die spezielle Lokalisierung im distalen Tubulus der Niere könnte Msi-1 von großer Bedeutung in der akuten Nierenschädigung sein. Mittels eines eCLIP (enhanced crosslinking and immunoprecipitation) werden die exakten Ziel-RNAs von Msi-1 in distalen Tubuluszellen ermittelt. Weitere Experimente in Zellkultur und Knockout-Mausmodell werden nun einerseits die molekularbiologische Funktion dieser Proteine in Nierenzellen und andererseits ihre phänotypische Auswirkung auf die akute Nierenschädigung beleuchten.

 
Retrospective analysis of the efficacy of caplacizumab in the treatment of acquired thrombotic thrombocytopenic purpura – Results from the REACT-2020 study group
P120 

L. Kühne, L. Völker, J. Kaufeld, W. Miesbach, S. Brähler, M. Reinhardt, A. S. Mühlfeld, A. Schreiber, J. Gaedeke, M. Tölle, W. Jabs, F. Özcan, S. Markau, M. Girndt, F. Bauer, T. H. Westhoff, H. Felten, M. Hausberg, M. Brand, J. Gerth, M. Bieringer, M. Bommer, S. Zschiedrich, J. Schneider, S. Elitok, A. Gawlik, A. Gäckler, A. Kribben, V. Schwenger, U. Schönermarck, M. Roeder, J. Radermacher, J. Barmstedt, A. Morgner, R. Herbst, A. Harth, S. A. Potthoff, C. von Auer, R. Wendt, H. Christ, P. T. Brinkkötter, J. Menne; Köln, Hannover, Frankfurt a. M., St. Louis/USA, Aachen, Berlin, Dortmund, Halle (Saale), Herne, Karlsruhe, Münster, Zwickau, Göppingen, Freiburg, Potsdam, Essen, Stuttgart, München, Landshut, Minden, Bremerhaven, Chemnitz, Düsseldorf, Mainz, Leipzig

Objective: Acquired thrombotic thrombocytopenic purpura (aTTP) is a rare, but life-threatening autoimmune disease, clinically manifested by microvascular occlusions with subsequent organ ischemia. Scientific progress and improvement of patients’ outcome has been hampered in the past by the low incidence and difficulty of conducting powerful randomized prospective trials. Since its approval in Germany in 2018, the nanobody caplacizumab offers a new therapeutic approach for the treatment of adults experiencing an acute episode of aTTP. Here, we report the first real-world cohort of aTTP patients managed with caplacizumab
Method: We analyzed the prescription practice and the rationale to use caplacizumab during acute disease management as well as its efficacy in a national, retrospective cohort of 60 patients from 29 different medical centers that we systematically set up since the drug’s approval in 2018.
Results: Caplacizumab led to a rapid normalization of the platelet count (median 3, mean 3.78 days). 1 patient died after late treatment initiation due to aTTP-associated complications. In 2 patients with initial disease presentation and in 4 additional patients with laboratory signs of an exacerbation or relapse after the initial therapy PEX-free treatment regimens could be established with overall favorable outcome.
Conclusion: Caplacizumab is efficacious in the treatment of aTTP independent of timing and ancillary treatment modalities. Based on this real-world experience and published literature we propose to administer caplacizumab to all patients with an acute episode of aTTP immediately. Treatment decision regarding the use of PEX should be based on the severity of the clinical presentation and known risk factors. PEX might be dispensable in some patients.

 
Die kontralaterale Niere beeinflußt das Ergebnis nach einseitiger Nierenischämie
P121 

A. Polichnowski, C. Rosenberger, K. Griffin, S. Mathia, M. Venkatachalam, A. Bidani; Johnson City/USA, Berlin, Maywood/USA, San Antonio/USA

Hintergrund: Unilaterale renale Ischämie-Reperfusion (UIR) gilt als Modell für akutes Nierenversagen mit Übergang in chronisches Nierenversagen. Innerhalb von ca. 2 Wochen erholen sich UIR-Nieren mehr oder weniger, je nach Ischämiedauer. Gewebeumbau sorgt möglicherweise für Hypoxie und chronischen Schaden. Die Rolle der gesunden, kontralateralen Niere in diesem Prozeß ist unklar und soll hier untersucht werden.
Methode: In Sprague Dawley Ratten erfolgte eine UIR oder Sham-OP der linken Niere (Tag 0), eine rechte Nephrektomie (UNX) oder Sham-OP (Tag 14), eine Nierenentnahme (Tag 28). Arterieller Blutdruck und linker renaler Blutfluß (RBF) wurden invasiv am wachen Tier bestimmt. Die GFR wurde mittels Inulin-Clearance bestimmt. Gewebehypoxie wurde mittels Immunhistochemie für HIF-1α und Pimonidazol bestimmt. Das Ausmaß des chronischen Nierenschadens wurde mittels konventioneller Histologie und Immunhistochemie für Fibrosemarker bestimmt.
Ergebnisse: Am Tag 14 waren: mittlerer Blutdruck (MAP) in allen Gruppen vergleichbar bei 105 mmHg; nach UIR vs. Sham-UIR waren a) die GFR geringer, wenn auch nicht signifikant (2,9 vs 3,9 ml . min-1), b) der RBF signifikant geringer (3,5 vs. 9,3 ml . min-1) und c) der renale vaskuläre Widerstand signifikant höher (RVR; 38 vs 12,5 mmHg . min . ml-1).
Am Tag 28 waren nach UIR/UNX vs. Sham-UIR/Sham-UNX signifikant unterschiedlich: MAP 130 vs. 105 mmHg; RBF 6,3 vs 12 ml . min-1; GFR 1,4 vs. 2,5 ml . min-1; RVR (25 vs. 8 mmHg . min . ml-1); HIF-1α am stärksten präsent in UIR-Nieren nach UNX, gefolgt von kontralateralen Nieren nach UIR/Sham-UNX und UIR-Nieren nach Sham-UNX; im Vergleich dazu Pimonidazol-positive Tubuli zwar seltener, aber ebenfalls am stärksten ausgeprägt in UIR-Nieren nach UNX; Vimentin-positive Tubuli nicht nachweisbar in rechten kontralateralen Nieren, jedoch sehr ausgeprägt nach URI/Sham-UNX und signifikant weniger nach URI/UNX. In Folgeschnitten war die überwiegende Zahl an HIF-1α-positiven Tubuli Vimentin-negativ.

P113-1
P113-2

Zusammenfassung: Kontralaterale Nephrektomie fördert die morphologische und funktionelle Erholung nach unilateraler renaler Ischämie-Reperfusion. Kompensatorische Nierenhypertophie, wie in der gesunden kontralateralen Niere und, noch ausgeprägter, in der linken UIR-Niere nach rechter UNX wird begleitet von renaler Hypoxie und Hypoxie-Anpassung. HIF scheint in diesem Prozeß vergesellschaftet mit Gewebeanpassung und -erholung.

 
Evaluation von Retentionsparametern als Surrogat zur Abschätzung der glomerulären Filtrationsrate bei dekompensierter Herzinsuffizienz
P122 

J. Swolinsky, E. Tuvshinbat, D. Leistner, F. Edelmann, F. Knebel, N. Nerger, C. Lemke, E. Gasanin, V. Mitrovic, D. Meier, K.-U. Eckardt, B. A. Molitoris, K. M. Schmidt-Ott; Berlin, Bad Nauheim, Carmel/USA, Indianapolis/USA

Hintergrund: Die Überwachung der Nierenfunktion bei Patienten mit akut dekompensierter Herzinsuffizienz (ADHF) erfolgt im klinischen Alltag üblicherweise durch die serielle Messung endogener Filtrationsmarker wie Serumkreatinin (SCr) und Cystatin C (CysC) als Surrogatmarker der glomerulären Filtrationsrate (GFR). Ziel der Studie war zu untersuchen, ob bei Patienten mit ADHF die Serumkreatinin- und/oder Cystatin C-basierte Schätzformeln der GFR ein adäquates Maß für die gemessene GFR (mGFR) bzw. für Veränderungen der mGFR darstellen.
Methode: In dieser prospektiven Kohortenstudie an 50 hospitalisierten Patienten mit ADHF, erfolgte während der diuretischen Therapie die Messung von SCr und CysC zur Bestimmung von 5 etablierten formelbasierten GFR-Schätzungen (eGFR) und zur Identifikation von akuter Nierenschädigung (AKI). Bei allen 50 Patienten erfolgte eine parallele Messung der GFR (mGFR) durch einen fluoreszenzmarkierten Zweikomponenten-Tracer. 38 Patienten erhielten eine zweite serielle mGFR-Bestimmung im Abstand von 48h, um den zeitlichen Verlauf der mGFR zu beurteilen. Die eGFR, formelbasierte 48h-Veränderungen sowie die AKI-Kreatinin-Definition wurden mit der mGFR und mGFR-Dynamiken verglichen. Bland-Altman Plots, Pearson’s Korrelationskoeffizient, Genauigkeit, Präzision und systematischer Bias wurden für die Schätzformeln und die 48h-Veränderung berechnet. Sensitivität, Spezifität, positiv und negativ prädiktiver Wert wurden für AKI-Diagnose und mGFR-Verlust >15% berechnet.
Ergebnisse: Serumkreatinin- und Cystatin-C-basierte Schätzungen der GFR korrelierten moderat mit der mGFR (r=0,80-0,88, Präzision r2=0,65-0,78, in Abhängigkeit von der jeweiligen Formel) bei jedoch schwacher Genauigkeit (nur 56 -74% der Schätzer lagen im 30% Radius der mGFR). Veränderung der Filtrationsmarker und deren GFR-Schätzer während 48h diuretischer Therapie zeigten keinen aussagekräftigen Wert zur Schätzung der mGFR-Veränderung im gleichen Zeitfenster. Relevante mGFR-Verluste, die auf eine AKI hindeuten, wurden durch das AKI KDIGO Serumkreatininkriterium häufig nicht detektiert (Sensitivität 55%).
Zusammenfassung: In hospitalisierten Patienten mit ADHF unter diuretischer Therapie zeigten AKI-Kriterien und etablierte Schätzformeln basierend auf SCr und CysC erhebliche Limitationen in der Abschätzung der gemessenen GFR und ihrer Veränderungen.

 
Retrospektive Studie: Häufigkeit akuter Nierenschädigung bei liberalem Einsatz von Kontrastmitteln in der bildgebender Diagnostik
P123 

S. Kukhlevskyy, C. Erley, M. Tölle; Berlin

Hintergrund: Lange ging man davon aus, dass sich der Einsatz von Kontrastmitteln (KM) im Rahmen einer bildgebenden Diagnostik im Rahmen der Patientenbehandlung negativ auf der Nierenfunktion auswirken kann, bzw. ein akutes Nierenversagen (ANV) hervorruft. Diagnostische und therapeutische KM-basierte Methoden wurden daher bei nierenkranken Patienten sehr restriktiv eingesetzt.
Methode: Diese retrospektive Studie untersucht den Einsatz jodhaltiger und nicht jodhaltiger Kontrastmittel in einem Krankenhaus mit einer großen nephrologischen Abteilung. Patienten, die zwei Kreatinin-Messungen vor und nach der bildgebenden Untersuchung bekamen, wurden eingeschlossen. Auf der Basis der Differenz dieser beiden Werte erfolgte die Bewertung zum Vorhandensein der akuten Nierenschädigung. Im weiteren Schritt wurde eine Einteilung in drei Stadien des akuten Nieren-versagens durchgeführt.
Ergebnisse: Ergebnisse: lediglich bei 8,6% der Patienten hat sich nach der Gabe des Kontrastmittels ein akutes Nierenversagen entwickelt. Im weiteren Schritt haben wir uns genauer die Gruppe der Patienten angeschaut, die ein ANV aufwiesen. Die Differenzierung der Patientenfälle erfolgte nach den AKIN-Kriterien. Bei der überwiegenden Mehrheit dieser Patienten (91,8%) wurde ein AKIN-1 Stadium des ANV nachgewiesen, 44 (6,3%) Fälle zeigten ein AKIN-2 Stadium und nur 13 (1,9%) Personen von 8.060 analysierten Fällen wiese ein AKIN-3 Stadium auf.
Bei Patienten mit ANV wurde die Mehrheit der Untersuchungen (93,8%) der bildgebenden Diagnostik mit jodhaltigen Mitteln durchgeführt (CT und DSA). Der Anteil der Untersuchungen mit nicht-jodhaltigem Kontrastmittel betrug 6,2% (MRT mit gadoliniumhaltigem KM). Trotzdem finden sich in dieser kleinen Gruppe die Patienten mit ANV in Stadium 2 und 3. 
Zusammenfassung: Anhand dieser retrospektiven Untersuchung ergeben sich folgende Aspekte:
- Die Nutzen-Risiko Abwägung bei Verwendung von Kontrastmittel ist günstig. Nur in 8,6% der Patientenfälle konnte bei liberalem Einsatz von Kontrastmitteln ein ANV nachgewiesen werden.
- Lediglich 0,7% aller Patienten wies ein AKIN Stadium 2 und 3 des ANV auf.
- Es konnte kein Unterschied zwischen der Gabe von jodhaltigen und nicht-jodhaltigen Kontrastmitteln festgestellt werden. Ungefähr zu gleichen Anteilen haben Patienten in beiden Fällen ein ANV entwickelt.
- Im Falle der Gabe von Gadolinium nicht-jodhaltigen Kontrastmitteln traten vermehrt AKIN-Stadien 2 und 3 auf.
- Die meisten Fälle der akuten Nierenschädigung wurden in der Altersgruppe 60-80 Jahre festgestellt.

P123-1
P123-2
 
Modulation des RNA-Protein-Interaktoms durch Aktivierung von Hypoxie-Signaling im Modellorganismus C. elegans
P124 

R. Esmaillie, M. Ignarski, K. Bohl, L. Seufert, B. Schermer, T. Benzing, R.-U. Müller, F. Fabretti; Köln

Hintergrund: Die Aktivierung zellulärer Stressresistenzmechanismen ist eine vielversprechende Strategie, um akute Nierenschädigungen zu verhindern. Hierzu werden unterschiedliche Präkonditionierungs-Strategien untersucht. Eines der bekanntesten Protokolle verwendet limitierte Hypoxie („hypoxic preconditioning“), wobei der protektive molekulare Mechanismus nur unzureichend verstanden ist. Wir verwenden den Nematoden C. elegans als Modell zur Untersuchung der Hypoxie-Antwort und haben uns auf die Bedeutung RNA-bindender Proteine (RBP) fokussiert. Hierbei wurde das globale RBPome in Wildtyp sowie Würmern mit konstitutiv aktiviertem HIF-Signaling (Hypoxie-induzierbare Faktoren) untersucht.
Methode: Die globale Identifikation von RBPs erfolgte unter Verwendung von „RNA interactome capture“ (RIC), welche UV-Crosslinking mit einem oligodT-bead basierten „Pulldown“ kombiniert. Die Proteine selbst werden im Anschluss hieran massenspektrometrisch quantifiziert. Hierbei haben wir das RBPome aus Wildtyp und vhl-1 knockout Würmern verglichen.
Ergebnisse: Wir konnten 1354 RBPs in C. elegans identifizieren. Hierbei wurden 270 RBPs erstmalig in dieser Funktion charakterisiert, während es sich bei den restlichen um bekannte RBPs handelt. Interessanterweise sind 80 der identifizierten RBPs in der vhl-1 Mutante reguliert. Durch Quantifizierung des Proteoms konnten wir zeigen dass primär die RNA-Bindung dieser Proteine und nicht deren Abundanz beeinflusst wird. Durch Verwendung der automatisierten „Lifespan Machine“ konnten wir erste Screens zur Untersuchung der Lebensspanne des Nematoden durchführen.
Zusammenfassung: Wir konnten erstmalig die globale Regulation des RBPome durch HIF-Signaling im Nematoden beschreiben. Die hierbei identifizierten und durch HIF-Aktivierung modulierten RBPs sind nun interessante Kandidaten für weitere Untersuchungen einer Funktion in Stressresistenz, Lebensspanne und Nierenschädigung. Primär werden wir hierzu weitere Screens zur Lebensspanne des Nematoden durchführen, um die Zahl der im Mausmodell zu untersuchenden Proteine zu begrenzen.

 
Klinische und anatomische Gründe die gegen die Verwendung einer 70 mm Seldinger Nadel bei der Punktion der V. jug. int. sprechen
P125 

C. Wenzel, H. Kielstein, T. M. Meyer, J. T. Kielstein; Braunschweig, Halle (Saale)

Hintergrund: Bei der Anlage Zentraler Venenkatheter können diverse Komplikationen auftreten, deren Schwere von der Art der veletzten Struktur abhängig ist. Die gängigen Seldinger Nadeln für die ZVK-Analge, die beim Erwachsenen verwendet werden, sind 70 mm lang und damit länger als notwendig. 70 mm ist sogar lang genug um tiefer liegende Strukturen wie das Ganglion Stellatum zu schädigen auch wenn das Horner Syndroms nur bei bis zu 5 % der ZVK-Anlagen vorkommt. Die Hypothesen der Arbeit sind: #1) eine Kanülenlänge von 70 mm nicht notwendig ist, um die Vena jugularis interna zu punktieren. #2) mit der 70 mm Seldinger Nadel kann bei den meisten Menschen sogar das Ganglion Stellatum erreich werden.
Methode: Bei 34 Patientient*innen wurde eine Sonographie der Vena jugularis bds. durchgeführt, um den Abstand vom Hautniveau bis zur Vene zu messen. Hierdurch sollte die Mindestlänge der Seldinger Nadel bestimmt werden, um die Venenmitte zu erreichen. Zusätzlich wurde der Diameter der Vene bei 0 ° und 45 ° Neigung des Oberkörpers gemessen. Bei 80 Ethanol/Formalin fixierten Körperspendern wurden Abstand und Winkel bestimmt die notwendig waren um vom loco typico der Punktion der rechten V. jugularis interna das Ganglion Stellatum unter Sicht zu punktieren.
Ergebnisse: Bei den Patient*innen war der Median des Venendurchmessers in der 0° Position mit 0,58 cm deutlich größer als in der 45° Position, in der er 0,35 cm betrug.

P125-1


Der Abstand zwischen Haut und Vene korreliert mit dem BMI und dies unabhängig von der Lage des Oberkörpers oder der Halsseite. Der Maximalwert des Abstandes zwischen Haut und Vene lag bei 1,87 cm, der Median lag bei 1,15 cm.

P125-2


Selbst bei einem maximalen Abstand der Haut zur Vene von 1,87 cm und einer gängigen 70 mm Nadel würde diese bei 62 % der gemessenen Daten der Körperspender lang genug sein, um das Ganglion stellatum zu treffen und potentiell zur Komplikation des Horner Syndroms zu führen.
Zusammenfassung: Die Verwendung einer kürzeren Seldinger Nadel bei der Punktion der V. jung. int. würde Komplikationen wie z.B. die Verletzung des Ganglion Stellatum ausschließen.

 
Dosing recommendation of Fosfomycin in patients undergoing prolonged intermittent renal replacement therapy based on single and multiple dose pharmacokinetics
P126 

L. K. V. Gerecke, J. Schmidt, S. M. Bode-Böger, G. Eden, J. Martens-Lobenhoffer, C. Hafer, J. T. Kielstein; Braunschweig, Hannover, Magdeburg

Objective: Fosfomycin was introduced to clinical medicine about fifty years ago. Over the last years there has been a renaissance in the use of intravenous Fosfomycin for the treatment of patients with multi resistant bacteria. Fosfomycin is mainly excreted through renal elimination, so dose reduction is recommended in patients with impaired renal function and especially those requiring renal replacement therapy. As Fosfomycin was licensed half a century ago, dosing recommendations for patients undergoing modern means of renal replacement therapies are missing. Hence the aims of this study were to evaluate the pharmacokinetics of Fosfomycin in patients undergoing prolonged intermittent renal replacement therapy (PIRRT) and establish a dosing recommendation for this treatment method.
Method: Fosfomycin was given in ten (6 female, 4 male) patients with severe infections undergoing PIRRT (median dialysis time was 320 ± 58.8 min; Qb 250 ± 18.5 ml/min, Qd 250 ± 18.5 ml/min). Plasma levels were measured at several time points after the first dose of Fosfomycin, before, during and after the PIRRT; before and after the dialyzer to calculate its clearance; in the collected spent dialysate to determine the amount of Fosfomycin removed by dialysis; and if possible 5-6 days after the initial dose adhering to the same algorithm.
Results: The peak plasma levels after the first dose of Fosfomycin correlates with the weight-adjusted first dose. Off PIRRT elimination half-life of Fosfomycin was twice as long as in healthy individuals. The mean dialyzer clearance for Fosfomycin was 186.4 ± 50.5 ml/min, reducing the half-life on PIRRT to the values of patients with normal renal function. Based on the total amount of Fosfomycin in the collected spent dialysate 73 ± 8.8 % of the initial dose could be recovered in the dialysate. Data from multiple dose PK suggests that a dose of 5g t.i.d. does not lead to accumulation / increase of Cmax under dialysis therapy, but dose reduction to 5 g b.i.d. has to be considered on non-dialysis days.

P126

Conclusion: In patients undergoing PIRRT with the settings specified in our study require a Fosfomycin dose of 5g i.v. t.i.d. to reach adequate plasma levels on the days of dialysis. On non dialysis days a dose reduction to 5 g b.i.d. has to be considered.

 
ADAMTS13 and vWF activities guide individualized caplacizumab treatment in patients with aTTP – Results from the REACT-2020 study group
P127 

L. Völker, L. Kühne, J. Kaufeld, W. Miesbach, S. Brähler, M. Reinhardt, A. S. Mühlfeld, A. Schreiber, J. Gaedeke, M. Tölle, W. Jabs, F. Özcan, S. Markau, M. Girndt, F. Bauer, T. H. Westhoff, H. Felten, M. Hausberg, M. Brand, J. Gerth, M. Bieringer, M. Bommer, S. Zschiedrich, J. Schneider, S. Elitok, A. Gawlik, A. Gäckler, A. Kribben, V. Schwenger, U. Schönermarck, M. Roeder, J. Radermacher, J. Bramstedt, A. Morgner, R. Herbst, A. Harth, S. A. Potthoff, C. von Auer, R. Wendt, H. Christ, J. Menne, P. T. Brinkkötter; Köln, Hannover, Frankfurt a. M., Aachen, Berlin, Dortmund, Halle (Saale), Herne, Karlsruhe, Münster, Zwickau, Göppingen, Freiburg, Potsdam, Essen, Stuttgart, München, Landshut, Minden, Bremerhaven, Chemnitz, Düsseldorf, Mainz, Leipzig

Objective: The use of the nanobody caplacizumab was shown to be effective in the treatment of acquired thrombotic thrombocytopenic purpura (aTTP) in the acute setting. However, caplacizumab dramatically changes the disease course, uncoupling platelet dynamics from ADAMTS13 activity and thereby making the latter the central parameter for future disease management, especially during recovery. The official recommendations include plasma exchange (PEX), immunosuppression and the use of caplacizumab for a minimum of 30 days after stopping daily PEX.
Method: Retrospective, observational analysis on the use of caplacizumab in 60 patients from 29 medical centers in Germany.
Results: Immunosuppressive treatment led to a rapid normalization of the ADAMTS13 activities (calculated median 21 days). In 35/60 patients, ADAMTS13 activities started to normalize prior to day 30 after PEX while in 11/60 patients the treatment was extended beyond day 30, in 5 patients even beyond day 58 due to persistent autoimmune activity. In 34/60 instances, caplacizumab was stopped prior to day 30 with favorable outcome whenever ADAMTS13 activities were >10%. In contrast, 11/34 patients with ADAMTS13 activities <10% at the time of stopping caplacizumab treatment develop a non-favorable outcome comprising disease exacerbation or relapse. In some cases, prolongation of the treatment interval to every other day was feasible and resulted in a sustained reduction of the vWF activity.
Conclusion: ADAMTS13 activity measurements are central for a rapid diagnosis in the acute setting but also to tailor disease management. An ADAMTS13 activity guided approach appears safe to identify the individual time point when to stop caplacizumab to prevent over- and undertreatments resulting in significant cost savings without jeopardizing the well-being of patients. In addition, vWF activity may serve as biomarker for drug monitoring.

 
LAP-deficiency sensitizes mice to kidney ischemia-reperfusion injury
LA27 

W. Tonnus, S. Locke, M. Latk, A. von Mäßenhausen, D. Green, C. Hugo, A. Linkermann; Dresden, Memphis/USA

Objective: Recently, the concept of necroinflammation has been postulated proposing that cellular necrosis leads to an inflammatory reaction via the release of damage-associated molecular patterns (DAMPs). In consequence, this inflammation causes elevated necrosis, feeding a forward loop. Whereas recent effort started to elucidate the role of regulated necrosis in this system, evidence regarding the functional role of the inflammatory response is scarce.
Method: Mice lacking the endosomal scaffold protein Rubicon have been shown to be incapable of removing necrotic debris in a process called LC3-associated phagocytosis. These mice have been shown to develop a lupus-like autoinflammatory phenotype.
To assess the functional role of necroinflammation in AKI, we utilized those mice in ischemia-reperfusion injury (IRI).
Results: To this regard, we found Rubicon-deficient mice to be extremely sensitive as demonstrated by deteriorated levels of serum creatinine and urea, respectively. Furthermore, histopathological evaluation demonstrated more severe tubular necrosis, pointing to a functional role for the necroinflammatory loop in IRI.
We then started to assess the development of chronic kidney disease in wildtypes and Rubicon-deficient mice. To this end, we monitored groups of male and female mice over the course of one year and assessed kidney function and histopathological changes. This experiment is still ongoing and the first results are about to be reported.
Conclusion: In summary, we found evidence for an important functional role of necroinflammation in AKI, supporting this concept and paving the path for future therapeutic interventions.

 
Glutathione peroxidase 4 (GPX4) and Ferroptosis suppressor protein 1 (FSP1) suppress ferroptosis in mouse models of ischemia-reperfusion injury
LA28 

W. Tonnus, S. Locke, N. Zamora Gonzalez, J. U. Becker, A. von Mäßenhausen, M. Conrad, C. Hugo, A. Linkermann; Dresden, Köln, Neuherberg

Objective: Ferroptosis is a form of regulated necrosis, which is characterized by iron-dependent lipid peroxidation. To maintain cellular homeostasis, cells need to deploy redox systems to reduce those peroxides. It is known that GPX4, a protein containing a selenocysteine in its active center, is required to keep ferroptosis in check. Notably, specific deletion of GPX4 from the proximal tubule leads to chronic kidney disease, whereas a whole-body knock-out is embryonically lethal. Utilizing a tamoxifen-inducible system, the selenocysteine can be exchanged to a cysteine in the previously reported GPX4cys/- mouse model, leading to increased sensitivity to ferroptosis.
Another system involving coenzyme Q10 and the protein FSP1 has also recently been described to play an important role to prevent ferroptosis. FSP1-deficient mice are viable and fertile. To date, genetic evidence for the role of ferroptosis in acute kidney injury (AKI) is still lacking.
Method: We utilized the GPX4cys/- and FSP1-ko mice to seek genetic evidence for a contribution of ferroptosis in ischemia/reperfusion injury (IRI).
Results: 14 days after treatment with tamoxifen, GPX4cys/--mice underwent severe ischemia, which was lethal to 50 % of GPXwt/wt control mice. Interestingly, GPX4cys/--mice were extremely sensitive and all died within 48 hours. In a model of mild ischemia, GPX4cys/--mice displayed deteriorated levels of serum creatinine and urea. In histopathological evaluation, GPX4cys/--mice displayed widespread tubular necrosis with a vesicular morphology, which was reminiscent of a human biopsy taken for AKI evaluation. Intriguingly, GPX4cys/cys-mice did not display increased sensitivity to cisplatin-induced AKI, pointing to a specific role for ferroptosis IRI.
Furthermore, we used the FSP1-deficient mice to evaluate whether additional anti-ferroptotic systems are required in vivo. Surprisingly, FSP1-ko mice also demonstrated higher levels of serum creatinine and urea as well as more severe tubular necrosis after IRI.
Conclusion: In summary, we provide the first genetic evidence for the role of ferroptosis in AKI by utilizing two ferroptosis-sensitive mouse strains. Notably, both inhibitory redox systems tested here seem to work largely independent of each other, as both are required to suppress ferroptosis efficiently. As pharmacologic inhibitors of ferroptosis are under development, this genetic evidence is about to influence future therapies greatly.

 
Nec-1f inhibiert Nekroptose und Ferroptose in vitro und in vivo
LA29 

C. Meyer, W. Tonnus, N. Zamora Gonzalez, P. Hergenrother, C. Steinebach, G. Gütschow, A. von Mäßenhausen, C. Daniel, K. Amman, C. Hugo, A. Linkermann; Dresden, Urbana/USA, Bonn, Erlangen

Objective: Nec-1 is a small molecule targeting the Receptor-interacting serine/threonine-protein kinase 1 (RIPK1) and became the first known inhibitor of necroptosis, demonstrating the beneficial impact of suppressing regulated necrosis in renal ischemia-reperfusion injury (IRI). Whereas subsequent studies also established genetic evidence for the role of necroptosis in IRI, Nec-1 was found not only to block necroptosis, but also inhibit ferroptosis. The improved RIPK1 inhibitor Nec-1s lacks this feature. Recently, inhibitors of ferroptosis have been found to ameliorate pathology potently after IRI, pointing to a beneficial effect to block both necroptosis and ferroptosis simultaneously.
The dual features of Nec-1 make it a great scaffold to look for more potent anti-ferroptotic features whilst keeping the specific inhibition of the RIPK1 kinase.
Method: Thus, we restored the hydantoin in Nec-1s by a novel synthesis pathway, combining the positive effects of both Nec-1 and Nec-1s and named the improved compound Nec-1f. We tested its properties in vitro and in murine models of AKI.
Results: To test Nec-1f in vitro, a set of cell lines and freshly isolated tubules were challenged with different ferroptosis-inducing agents and cellular integrity was measured by FACS and LDH release, proving Nec-1f to efficiently suppress ferroptosis. Furthermore, necroptosis was induced in murine and human cell lines and Nec-1f also displayed potent anti-necroptotic efficacy. With combined stimulation of ferroptosis-inducing and necroptosis-inducing agents only Nec-1f, but not a specific inhibitor of necroptosis or ferroptosis alone, was able to maintain cellular integrity.
To test its in vivo capacities, we injected Nec-1f 15 minutes prior to IRI. In a severe ischemia, Nec-1f significantly improved survival rates compared to vehicle controls. Also, in a more moderate ischemia, Nec-1f ameliorated tubular damage and reduced the increase of serum creatinine and urea levels.
Conclusion: In conclusion, we generated a first-in-class combined inhibitor of both necroptosis and ferroptosis, which is effective both in vitro and in vivo.

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