Freitag, 02.10.2020

14:00 - 15:30

Poster DGfN 2020

Experimentelle Nephrologie 3 (P076 - P084; LA19 - LA20)

The Dual Endothelin ETA and Angiotensin AT1 Receptor Blocker Sparsentan Protects Against the Development of Albuminuria and Glomerulosclerosis in the gddY Mouse Model of IgA Nephropathy

H. Nagasawa, H. Suzuki, C. Jenkinson, S. Ueda, Y. Fukao, M. Nakayama, T. Otsuka, K. Liu, R. Komers, Y. Suzuki; Tokyo/J, San Diego/USA

Objective: gddY mice are an IgA nephropathy (IgAN) -prone mouse model that develops albuminuria by 8 weeks (wks) of age with glomerular IgA, IgG, and C3 deposits and progressive mesangioproliferative glomerulonephritis. A previous study in the ddY mouse model, the more genetically heterogeneous predecessor of gddY mice, using the endothelin type A receptor (ETA R) antagonist FR139317 resulted in amelioration of proteinuria and preservation of kidney function. Treatment of ddY mice with the angiotensin II type 1 receptor (AT1 R) blocker valsartan resulted in significant protection from glomerulosclerosis (GS) without a significant prevention in proteinuria. Here we examined the effect of sparsentan (SP), a dual ETA R and AT1R blocker, currently in phase 3 trials for focal segmental glomerulosclerosis and IgAN
Method: gddY mice at 4 wks of age were fed with control (C) chow (n = 5) or chow containing 900 ppm (n = 10) or 1800 ppm (n = 10) SP (approximately 180 and 360 mg / kg / day) for 8 wks. Albuminuria (U-Alb) was assessed at 4, 6, 8, and 12 wks of age and plasma levels of SP were determined at 8 am and 4 pm at wks 6, 8, and 12. Kidney biopsies were taken at the end of the study at 12 wks of age for processing and 30 glomeruli per animal were scored for the percentage of GS. Serum IgA and glycosylation of IgA was measured using ELISAs.
Results: gddY mice fed SP in the diet for 8 wks from 4 wks of age demonstrated significantly (* P <0.05) decreased U-Alb compared to mice fed the C diet (Figure 1). The development of GS in mice fed the diet containing 1800 ppm SP was significantly (* P <0.05) attenuated compared to C diet (Figure 2). Plasma levels of SP taken at 8 am and 4 pm after 8 wks of treatment were (mean ± SD) 281 ± 107 and 105 ± 62 ng / ml respectively for 900 ppm SP, and 774 ± 674 and 304 ± 176 ng / ml respectively for 1800 ppm SP. Weight gain in mice fed SP was not different from mice that received C diet. There was no difference in serum levels of IgA or aberrantly glycosylated IgA.


Conclusion: Eight weeks of treatment with SP significantly attenuated increases in albuminuria and GS associated with the development of IgAN in gddY mice. If translated to the clinic, these data support SP as a new approach to the treatment of IgAN.

Effect of the microenvironment on the morphology and transcriptome of induced renal tubular epithelial cells

L. Rizzo, M. Bühler, R. Pichler, S. Lienkamp; Zürich/CH, Freiburg

Objective: IRECs are induced renal tubular epithelial cells, and they are obtained by directly reprogramming mouse and human fibroblasts to epithelial kidney cells, using a lentiviral cocktail of four defined transcription factors (Hnf1b, Hnf4a, Pax8, Emx2). Given the great potential of this cell source, we analyzed how the microenvironment influences cell function and gene expression.
Method: We embedded iRECs in three ECM-like microenvironments (Matrigel, Fibrin and Collagen I) in two culturing media (DMEM and REGM). Morphology and viability were assessed at several time points after self-assembly. Moreover, mRNA was extracted, and RNA-Seq was carried out to describe common and unique differentially regulated genes with respect to the 2D control. Last, kidney specific gene sets were analyzed for each environment.
Results: IRECs show high viability in all microenvironments (> 70%) and they form smaller spherical aggregates in Matrigel, but elongated tubule-like structures in Collagen I. Transcriptomic analysis revealed differentially expressed signature genes in each of the used biomaterials. For example, expression of uptake machinery components was elevated in Matrigel embedded cells. In contrast, transcripts of ECM components showed strongest expression in the Fibrin condition.
Conclusion: Our findings will have implications for designing specific tubule microenvironments for reprogrammed tubule cells that better reflect physiological conditions. This will facilitate the choice of biomaterials to optimize the construction of biomimetic kidney tubule models in vitro.

Detailed epitope mapping of neutralizing anti-drug antibodies against recombinant a-galactosidase A in patients with Fabry disease

D. Scharnetzki, F. Stappers, M. Lenders, E. Brand; Münster

Objective: Fabry disease (FD) is an X-chromosomal-linked lysosomal storage disease caused by α-galactosidase A (AGAL) deficiency. Treatment with enzyme replacement therapy (ERT) substitutes deficient AGAL, but can also lead to the formation of neutralizing anti-drug antibodies (ADA). The presence of AGAL activity-inhibiting ADAs is associated with a more pronounced disease progression in affected male patients. As a basis for an individually tailored therapy, we performed a detailed epitope mapping of ADAs from antibody-positive males against infused AGAL.
Method: A comprehensive epitope mapping for 34 antibody-positive male FD patients was performed to identify potential common regions within AGAL recognized by ADAs. In silico analyses were used to analyze surface-located and buried epitopes and to assess potential epitope clusters. ELISA-based assays against α-galactosidase B (NAGA) were used to examine if ADAs recognize shared epitopes of AGAL and NAGA. To estimate if NAGA-recognizing ADAs against AGAL influence long-term clinical outcomes a subset of 20 patients was analyzed.
Results: Epitope mapping revealed that 30 % of the active site was located in very frequently ADA-recognized regions (Tyr134 within peptide 9; Glu203, Leu206, and Tyr207 within peptide 14). ADA recognition did not differ between surface-located and potentially buried epitopes (p=0.2764). ELISA-based analyses showed recognition of NAGA by anti-AGAL antibodies in 53 % of the patients with anti-AGAL antibodies. Patients with NAGA-recognizing anti-AGAL antibodies presented with lower NAGA activities in plasma (p=0.0080; r²=0.2001). There was no association between NAGA recognizing anti-AGAL antibodies and a more rapid disease progression. Nevertheless, patients with less NAGA activity showed a slightly lower eGFR decline over time.
Conclusion: The current study confirmed that AGAL antibodies bind to various epitopes, which confirms previous preliminary studies. Detailed epitope mapping could be the initial step for patient- and peptide-specific anti-ADA strategies.

Using CRISPR/Cas9-mediated gene modification for a better understanding of lysosomal storage diseases

S. Pollmann, M. Lenders, E. Brand; Münster

Objective: Lysosomal storage diseases (LSD) are inherited metabolic diseases causing lysosomal dysfunctions. Fabry disease (FD), one of the most prevalent X-linked LSDs is based on mutations within the α-galactosidase A gene (GLA/AGAL). AGAL is involved in the ceramide metabolism and a reduction or loss of enzymatic activity leads to a progressive accumulation of glycosphingolipids, mainly globotriaosylceramide (Gb3) and subsequent progressive multisystemic disorders. Current substrate reduction therapy for FD aims to reduce the synthesis of glucosylceramide (a precursor of Gb3) by inhibiting glucosylceramide synthase (GCS). In our current study we aim to analyze CRISPR/Cas9-mediated gene enhancement and silencing of GLA and GCS to modify ceramide metabolism on RNA level.
Method: Five different potential single-guide (sg)RNAs located within the GLA promoter were used for co-expression with an inactive Cas9 (dCas9) fused to three (VP48) or ten VP16 (VP160) activation domains. Constructs were co-transfected with a reporter gene construct containing the transcriptional regulatory sequence of GLA in different cell lines. In addition, four (sg)RNAs against the regulative sequence of the GCS were also used to investigate a silencing effect on GCS expression using an inhibitory KRAB-MeCP2 domain fused to dCas9. Effects on endogenous expression were investigated by measurement of enzymatic activity, Western Blot and qPCR.
Results: Co-expression of the GLA promoter-reporter gene construct with (sg)RNAs and dCas9-VP48/-VP160 constructs led to an increase in luciferase expression (p<0.001). The strongest effect (5-fold) was observed for a (sg)RNA that binds at the -381bp position. This effect was confirmed by analysis of the endogenous mRNA, which showed an up to 4-fold increase in mRNA expression, leading to increased AGAL protein expression and increased enzyme activities (p<0.001). Co-transfection of the GCS promoter-reporter gene construct with (sg)RNAs and dCas9-KRAB-MeCP2 resulted in a reduction of luciferase expression (p<0.0001) of all constructs. These results were also confirmed by a reduction of the endogenous GCS mRNA expression.
Conclusion: The current study revealed that appropriate CRISPR/Cas9-constructs can enhance and silence the expression of AGAL and GCS. In further studies the effect of up- and down-regulation of these genes on the intracellular accumulation of ceramides, especially Gb3 for FD will be analyzed.

Very low dose SGLT2 Inhibition is as effective as Angiotensin II Receptor Blockage in Treating cardiac Fibrosis in high salt 5/6 Nephrectomized Rats

S. Zeng, A. Hasan, D. Delic, Y. Xiong, C. Chu, L. Yin, S. Frankenreiter, B. K. Krämer, T. Klein, B. Hocher; Berlin, Potsdam, Biberach, Guangzhou/CN, Biberach an der Riß, Mannheim

Objective: SGLT2 inhibition has beneficial effects on cardiovascular and renal endpoints in animal models of chronic kidney disease as well as in several independent large clinical studies. The lowest effective dose, however, is unknown so far.
Method: We carried out a pharmacodynamic pilot study in non-diabetic rats. Based on these results we analyzed the effects of the SGLT2 inhibitor Empagliflozin in rats with 5/6 nephrectomy. The rats were allocated to the following groups: Sham + normal diet (ND) + placebo (PBO); 5/6Nx + 2 % high salt diet (HSD) + PBO; 5/6Nx + HSD + empagliflozin (1.2 mg/kg/day); 5/6Nx + HSD + Telmisartan (5 mg/kg/day); 5/6Nx + HSD + linagliptin (3 mg/kg/day). Rats were treated for 8 weeks. Fibrosis was evaluated after Sirius Red staining using computer-aided image analysis systems.
Results: The pilot study showed that empagliflozin increases urinary glucose excretion already at dosages (1.2 mg/kg/day) eight times lower than the so far used lowest empagliflozin dosages in CKD rat models. 5/6Nx rats on HSD treated with empagliflozin showed significantly (-29.95/-25.00 mmHg, p<0.001) lower blood pressure in comparison to the 5/6Nx rats on HSD treated with PBO and resulted in significantly reduced cardiac (- 34.85%; p<0.05) fibrosis. The effects of empagliflozin regarding blood pressure as well as cardiac fibrosis were comparable to the effects of the gold standard telmisartan (blood pressure: -31.89/-24.24 mmHg, p<0.001; cardiac fibrosis: - 36.37%; p<0.01) and with respect to fibrosis to linagliptin (cardiac fibrosis: -50.01%; p<0.001). RNA-sequencing revealed that many genes were differentially regulated among the groups. For example, transferrin receptor (Trfc), A-kinase anchor protein 1 (Akap1), and mitogen-activated protein kinase 9 (Mapk9) were affected by empagliflozin and telmisartan treatment while Caspase 1 (Casp1) gene expression was altered by empagliflozin treatment only in the heart.
Conclusion: A very low dose of empagliflozin was almost as effective as standard dosages of telmisartan or linagliptin in counteracting the increase in blood pressure as well as the development of cardiac fibrosis. The mechanisms underlying these effects involve the regulation of genes regulating cardiac fibrosis.

Bag3 as potential mechanoprotector in renal podocytes

I. Plagmann, M. Rinschen, K. Heinlein, J. Degenhardt, D. Unnersjö-Jess, S. Köhler, B. Schermer, T. Benzing; Köln, La Jolla/USA, Edinburgh/UK

Objective: Podocyte loss is a hallmark of glomerular diseases leading to glomerulosclerosis and progresssion of kidney disease. Sitting on the outside of the glomerular tuft podocytes have to withstand extensive mechanical stress due to perfusion and filtration. Hyperfiltration and hyperperfusion e.g. in disease states cause podocyte detachment when overwhelming their mechonoprotective capacity, which starts a vicious cycle of mounting strain on the remaining podocytes. Bag3 is an important mechanoprotector in many mechanical strained tissues and by inducing chaperone-assisted autophagy (CASA) maintains the proteostasis of e.g. Filamin and Synaptopodin – indispensable for podocyte biology. Additionally Bag3 insufficiency renders susceptibility to diabetic nephropathy in a mouse model. These findings point toward Bag3 as a candidate for mechanical stress protection in podocytes.
Method: Using immunofluorescence, super-resolution-microscopy and massspectrometry we examined glomeruli and podocytes for Bag3/CASA expression and characterized the CASA-complex composition in podocytes by immunoprecipitation. The influence of mechanical clues was examined by stiff matrices and cyclic stretch. The role of Bag3 in vivo is being evaluated in different mouse lines (Bag3.P209L mutation, a conditional knockout, fusion-protein).
Results: In the glomerulus the Bag3 and the entire CASA-complex is enriched in podocytes in mass-spectrometry. Bag3 staining localizes to the slit diaphragm protein nephrin in superresolution microscopy. Importantly the co-chaperone Bag3 shows interaction with essential actin-cytoskeleton regulators like RhoA, Arpc2 and Dynamin2 in co-immunoprecipitation. The expression of Bag3 and the CASA-complex in podocytes is regulated by mechanical clues. Knockdown of the Bag3 homologue starvin in drosophila nephrocytes displays a mild filtration disturbance. The dominant-negative Bag3.P209L mutation causes a mild proteinuria in a whole-body overexpression mouse line.
Conclusion: The data emphasizes the role of Bag3 and chaperone-assisted selective-autophagy in podocyte mechanoprotection and maintenance of podocyte cytoskeleton architecture. Currently undergoing characterization of podocyte specific Bag3 mouse lines and the use of disease models will further help to understand the role of Bag3 at the kidney filtration barrier.

Diabetic Nephropathy leads to Glomerular PLVAP Expression

A. Steglich, E. Wolf, F. Kessel, F. Gembardt, J. Sradnick, S. Reichelt-Wurm, K. Eidenschink, M. C. Banas, C. Hugo, V. Todorov; Dresden, Regensburg

Objective: The plasmalemma vesicle associated protein (PLVAP) is the main component of endothelial diaphragms in fenestrae, caveolae and transendothelial channels. In the adult kidney PLVAP is absent in glomerular capillaries because the endothelium lacks diaphragms in the fenestrae. In former studies glomerular expression of PLVAP has been reported in models of renal endothelial injury such as transplant glomerulopathy, Thy-1.1 glomerulonephritis and thrombotic microangiopathy in mice with defective Gsα/cAMP signaling in renin cells. Endothelial injury plays a major role in development and progression of diabetic nephropathy. Therefore, we aimed to investigate the PLVAP expression in glomerular capillaries in different models of diabetic nephropathy.
Method: 16-week-old black and tan brachyuric (BTBR) ob/ob mice, with a spontaneous mutation in the leptin gene, were used as a model of type 2 diabetes. To induce a model of type 1 diabetes, one dose of Streptozotocin (STZ, 180 mg/kg) was administered by intraperitoneal injection in 6-8 weeks old mice. Immunohistochemical staining and analysis was performed to examine the expression of PLVAP. We co-stained the Intercellular Adhesion Molecule 2 (ICAM2) as a marker for endothelial cells.
Results: Using immunohistochemical analysis, the BTBR ob/ob mice and the STZ mice revealed significantly increased PLVAP expression in their glomeruli, as compared with their controls (p<0.05 respectively). In STZ mice glomerular ICAM2 expression tended to decrease. As compared to the controls, the expression of ICAM2 was significantly decreased in BTBR ob/ob mice (p<0.05). Glomerular hypertrophy was found in BTBR ob/ob mice and STZ mice, which was interpreted as evidence for successful induction of diabetic nephropathy (STZ: 2750 µm2, control: 2527 µm2; BTBR ob/ob: 4471 µm2, control: 2295 µm2).
Conclusion: Our results show that diabetic nephropathy induces glomerular expression of PLVAP. Therefore, PLVAP could serve as a potential novel marker for endothelial injury in diabetic nephropathy.

MORG1 als Modulator des gestörten Lipidstoffwechsels in der kranken und gealterten Niere

I. Löffler, G. B. Wolf; Jena

Hintergrund: Ein gestörter Lipidmetabolismus in Tubuluszellen, der in hypoxischen und diabetischen, aber auch in alternden Nieren als pathologischer Mechanismus beschrieben wird, trägt entscheidend zur renalen Fibrose bei. Eigene tierexperimentelle Arbeiten zur Nierenfibrose bei Hypoxie und Diabetes mellitus Typ 2 (T2DM) identifizierten Morg1 als ein Genprodukt, das in der profibrotischen Signalkette eine entscheidende Rolle spielt, da Tiere, die weniger Morg1 exprimierten (heterozygote Morg1-Mäuse), auch weniger funktionelle und strukturelle Veränderungen der Nieren aufwiesen. Morg1 ist ein Gerüstprotein im Erk- wie auch im HIF-Signalweg und da beide Wege den Lipidstoffwechsel in Tubuluszellen regulieren, stellt sich die Frage, ob die renoprotektiven Eigenschaften der Morg1-Reduktion auf der Wiederherstellung des gestörten Lipidmetabolismus beruhen und ob dieser Morg1-abhängige Schutz vor Fibrose auch im Typ 1 DM und in der alternden Niere nachweisbar ist. Ebenfalls unklar ist, ob Morg1 in Abhängigkeit des pathologischen Stimulus an verschiedenen Stellen des Stoffwechsels eingreift und/oder eine differentielle Funktion im HIF- und Erk-Signalweg ausübt.

Methode: In Wildtyp- und in heterozygoten Morg1-Mäusen wurden Nierenerkrankungen durch folgende Modelle induziert: systemische Hypoxie (10% O2 in Atemluft); T1DM durch STZ-Applikation; T2DM durch Verpaarung mit db/db-Mäusen. Im Altersmodell wurden junge (<10 Wo.) mit alten (>1 Jahr) Tieren verglichen. Die renalen mRNA- und Proteinexpressionen von Fibrosemarkern, sowie Schlüsselenzymen des Triglycerid- und Cholesterolstoffwechsels wurden analysiert.

Ergebnisse: Die vorläufigen Daten zeigen, dass die Morg1-Reduktion unabhängig von der Ätiologie die induzierte Nierenfibrose senkt und den gestörten Lipidmetabolismus teilweise wiederherstellt. In Abhängigkeit von den zugrundeliegenden pathologischen Umständen zeigt sich jedoch, dass Morg1 an unterschiedlichen Stellen des Lipidstoffwechsels als Modulator zu agieren scheint. So ist Morg1 beispielsweise im T1DM eher an der Fettsäureoxidation beteiligt und im T2DM eher an der Cholesterolsynthese.

Zusammenfassung: Die Vorarbeiten deuten darauf hin, dass die renoprotektive Wirkung der Morg1-Reduktion u.a. auf eine teilweise Wiederherstellung des gestörten Lipidmetabolismus zurückzuführen ist. Die exakte Rolle, die Morg1 im gestörten Lipidstoffwechsel spielt, scheint von der Ätiologie und vermutlich einer unterschiedlichen „Bedienung“ des HIF- versus Erk-Signalweges abzuhängen.

Geschlechtsunterschiede bei diabetes- und TGF-ß1-induzierten Nierenschäden

N. Ziller, M. Liebisch, R. Mrowka, A. Baniahmad, G. B. Wolf, I. Löffler; Jena

Hintergrund: Die Literaturdaten zu Geschlechtsunterschieden bei der Entstehung und Progression der diabetischen Nephropathie (DN) stellen sich kontrovers dar. Unseres Wissens gibt es derzeit noch keine humane oder tierexperimentelle Studie, die eine eindeutige Aussage zum Einfluss des Geschlechts auf die Ausprägung der DN trifft. Der transformierende Wachstumsfaktor beta 1 (TGF-b1) spielt neben der Hyperglykämie eine wesentliche Rolle bei der Initiation unterschiedlichster Prozesse, wie Inflammation und tubulointerstitieller Fibrose, die zur Entstehung der DN führen. Ziel dieser Studie ist, die widersprüchlichen Daten zu Geschlechtsunterschieden sowohl bei diabetes- als auch bei TGF-b1-induzierten renalen Schädigungen aufzulösen und dabei die Rolle der Sexualhormone bzw. der genetischen Ausstattung zu untersuchen.
Methode: In ex vivo-Experimenten wurden 1mm-Gewebestückchen aus Nierenkortizes weiblicher und männlicher Mäuse mit TGF-b1 in An- bzw. Abwesenheit der Sexualhormone Dihydrotestosteron (DHT) und b-Estradiol stimuliert und Expressionsanalysen fibrotischer Marker durchgeführt. Im in vivo-Ansatz wurden in nicht-diabetischen und diabetischen Tieren beiden Geschlechts, die Sexualhormonkonzentrationen im Serum bestimmt und die renalen Expressionen von Fibrosemarkern sowie der Androgen-/Estrogen-Rezeptoren analysiert.
Ergebnisse: Erste Anzeichen deuten darauf hin, dass sowohl die genetische Ausstattung als auch die Regulation der Sexualhormone die Geschlechtsunterschiede in der DN bestimmen. Expressionsanalysen des Fibrosemarkers CTGF (connective tissue growth factor) zeigten beispielsweise, dass die Induktion von CTGF in Gegenwart von DHT geschlechtsspezifisch sowie abhängig von der TGF-b1-Konzentration verstärkt oder vermindert wird. Darüber hinaus beeinflusst der Diabetes mellitus die Konzentration der Sexualhormone und die Expression ihrer Rezeptoren geschlechtsabhängig: während ß-Estradiol sowie sein Rezeptor in diabetischen Männchen hochreguliert werden, kommt es in diabetischen Weibchen zu einer Abnahme im Vergleich zu gesunden Mäusen.
Zusammenfassung: Unsere Daten belegen signifikante Geschlechtsunterschiede bei diabetes- und TGF-b1-induzierten Nierenschädigungen. Die Untersuchungen zeigen einen deutlichen Einfluss der Sexualhormone, aber auch der geschlechtlich-genetischen Ausstattung, die in Abhängigkeit zum Stimulus zu sein scheint. Diese Studie trägt dazu bei, die widersprüchlichen Literaturdaten zu Geschlechtsunterschieden bei diabetischen Nierenerkrankungen aufzuklären.

Zebrafisch-Xenotransplantation als neuer Ansatz für in vivo Seneszenzforschung

V. C. Wulfmeyer, M. Swallow, K. Bancroft, C. M. Liao, P. Schroder, L. Beverly-Staggs, R. Korstanje, H. Haller, A. Melk, R. Schmitt; Hannover, Bar Harbor/USA

Hintergrund: Seneszenz und der mit ihr verbundene Seneszenz-assoziierte sekretorische Phänotyp (SASP) wird für altersassoziierte Erkrankungen verantwortlich gemacht. Die Etablierung eines Modells zur in vivo Analyse seneszenter Zellen in einem einfachen Modellorganismus mit der Möglichkeit einer Hochdurchsatztestung potentieller Senolytika war Ziel dieser Untersuchung.
Methode: Murine primäre Tubulusepithelzellen (PTEC) wurden extrahiert. An Tag 6 post Extraktion erfolgte die Seneszenzinduktion mittels γ-Bestrahlung (10 Gy). PTEC Tag 9 (nicht bestrahlt, nicht-seneszente Kontrolle) und Tag 16 (bestrahlte PTEC, seneszent) wurden injiziert. Die Injektion der fluoreszenzmarkierten PTEC (eFluor450/NucBlue) erfolgte in Zebrafischlarven (Nacre, flk bzw. NF-κB) an Tag 2 nach Fertilisation (dpf) in den Dottersack (mind. 30 Larven je Gruppe). Es erfolgten tägliche Beurteilungen der lichtmikroskopischen (LM) Larvenmorphologie sowie Zählungen der überlebenden Tiere bis 7 dpf inkl. Evaluation der Gefäßmorphologie bzw. der NF-κB Aktivierung. An 7 dpf erfolgte eine SA-β-Gal whole mount Färbung der Larven.
Ergebnisse: Die Zellinjektionen wurden auf 300 PTEC/Larve optimiert, die Umgebungstemperatur auf 34 °C. Eine fluoreszenzmikroskopische Kontrolle sicherte den Injektionserfolg. Die PTEC verblieben ortständig im Dottersack und die Larvenmorphologie war LM unverändert. Die Gefäßentwicklung verlief normal, ebenso zeigte sich keine Aktivierung von NF-κB. Allerdings kam es zu einer massiven Beeinflussung des Larvenüberlebens, wobei ab 4 dpf ein klarer Überlebensnachteil für die mit seneszenten PTEC injizierten Larven bestand (im Mittel 35,3 vs. 59,3 % Überlebende). Dieser Nachteil verstärkte sich bis 7 dpf auf 13,4 vs. 46,4 %. Die SA-β-Gal Färbung zeigte dabei keinen Hinweis auf eine sich in der Fischlarve ausbreitende Seneszenz.
Zusammenfassung: Die Xenotransplantation seneszenter Säugetierzellen in Zebrafischlarven stellt ein neues System dar, welches in vivo Untersuchungen in einem einfachen Modellorganismus erlaubt. Dieses Modell weist auf einen klaren Überlebensnachteil nach Xenotransplantation seneszenter Zellen hin ohne weitere offensichtliche Beeinflussung der Larven. Als solches eignet es sich für zukünftige Testungen potentieller Senolytika insbesondere hinsichtlich der selektiven Elimination seneszenter Zellen im lebenden Organismus. Das Zebrafischmodell ermöglicht darüber hinaus eine zeiteffiziente Testung mit hoher Stichprobengröße.

Sekretion des Kälteschockproteins DbpA unter inflammatorischen Bedingungen

G. Hoppstock, S. Stolze, C. Zhu, J. Lindquist, P. R. Mertens; Magdeburg

Hintergrund: DNA bindendes Protein A (DbpA) gehört zur Familie der Kälteschockproteine und wird sowohl im Entzündungsmodell als auch in verschiedenen malignen Erkrankungen aktiv sezerniert. Es konnte gezeigt werden, dass sich extrazelluläres DbpA von intrazellulärem DbpA strukturell unterscheidet und eventuell posttranslational modifiziert ist. Wir möchten diese Modifikationen identifizieren und die Wirkung von extrazellulärem DbpA auf die Zelle beschreiben sowie den Sekretionsweg charakterisieren.
Methode: Um die Sekretion von DbpA zu untersuchen, wurden Rattenmesangialzellen (rMC) und humane embryonale Nierenzellen (HEK) mit PDGF-BB und TGF-β1 sowie die humane Monozytenzelllinie THP-1 mit ATP und LPS stimuliert. Wir haben sowohl die intrazelluläre DbpA Induktion durch Isolation der Proteine aus den Zelllysaten als auch die Sekretion von DbpA durch die Fällung der Proteine aus den Zellüberständen untersucht. Für die Betrachtungen wurden vor allem Western Blot Analysen und ein DbpA-ELISA angewendet.
Ergebnisse: Es wurde gezeigt, dass Rattenmesangialzellen (rMC) durch Stimulation mit PDGF-BB und TGF-β1 DbpA sezernieren. In der Western Blot Analyse unterscheidet sich die Größe von intrazellulärem und extrazellulärem DbpA, wobei extrazelluläres DbpA größer ist als intrazelluläres. Die Stimulation anderer Nierenzellen, wie humaner embryonaler Nierenzellen (HEK), zeigt keine DbpA Induktion oder Sekretion. In der humanen Monozyten Zelllinie THP-1 wurde eine ATP induzierte DbpA Induktion intrazellulär nachgewiesen.
Zusammenfassung: Die Erzeugung eines inflammatorischen Milieus in vitro führt zu einer Sekretion von DbpA in Nierenzellen, die unter physiologischen Bedingungen nicht besteht. Deshalb nehmen wir an, dass extrazelluläres DbpA wichtige Funktionen in der Pathogenese von entzündlichen Nierenkrankheiten sowie verschiedenen Malignomen erfüllt und folglich in Zukunft als Marker für diese Erkrankungen genutzt werden kann. Im weiteren Verlauf sollen (i) extrazelluläres DbpA affinitätsgereinigt und durch massenspektrometrische Untersuchungen Modifikationen identifiziert werden. (ii) Die Wirkung von sezerniertem DbpA auf Zellen und dadurch resultierende intrazelluläre Signalaktivierungen sollen durch Stimulation mit aufgereinigtem extrazellulärem DbpA untersucht werden. (iii) Der Sekretionsweg soll durch den Einsatz von Signalweginhibitoren und Mikroskopie zur Anreicherung von DbpA in verschiedenen Zellkompartimenten erforscht werden.


Fragen und Antworten der Posterbewerter und Autoren

Kommentar von Nadja Ziller |


Kommentar von Ivonne Löffler |

Sehr geehrte Damen und Herren,
bitte beachten Sie, dass die beiden Ko-Autoren Eric Jankowski und Sophie Wulf entscheidende Arbeiten zum Poster P083 erst nach dem Zeitpunkt der Abstrakt-Einreichung beigetragen haben und somit ursprünglich als Autoren nicht angegeben wurden.
Vielen Dank für Ihr Verständnis.
Mit freundlichen Grüßen,
Ivonne Löffler

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